### 细胞裂解液的制备方法

#### 一、试剂准备

1. **新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液**：
- 150 mM NaCl
- 1% NP-40（去垢剂）
- 0.1% SDS（去垢剂）
- 2 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 2 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
- 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
- 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，可选）
以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. **冷的PBS**中加入：
- 1 mM PMSF
- 15 mM EDTA
- 1 mM Na Vanadate（钒酸钠，可选）

3. **细胞培养**：选择生长状态良好的对数期细胞，准备75 cm²培养瓶至少3-4瓶（90%以上细胞生长面积）。

#### 二、实验步骤

1. 将长满细胞的培养瓶放置在冰上，使用吸液管吸出培养液。加入足够的冷PBS充分洗涤细胞表面，以去除培养基残留，倒掉PBS，重复2-3遍。最后一次洗涤时尽量吸干残留的PBS，并在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶加入1 ml），使用细胞刮刀沿瓶壁刮取细胞。如果需要处理多瓶相同细胞，将第一瓶刮取的细胞液转移至下一瓶继续刮取（由于处理后的细胞裂解液较为粘稠，宜用较大口径的吸液管吸取）。

3. 将刮取的细胞裂解液转移至14 ml离心管中（保持在冰上），随后重复步骤2以收集其余细胞。

4. 尽量将所有细胞裂解液收集至14 ml离心管中，样品放入冰盒进行超声处理，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，进行10000 rpm离心10分钟，保留上清液。

5. 取出少量细胞裂解液以测定其蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280波长下测定），样品分装并保存于-70℃。

### 物理或化学方法进行细胞裂解

**物理方法**：
- （1）反复冻融：在-20℃和25-30℃环境中交替冷冻与解冻10-20次，适用于大部分哺乳动物细胞。
- （2）煮沸法：将细胞放置在100℃沸水中煮5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
- （3）超声法：在超声波破碎仪中以适当频率破碎细胞，适用于绝大多数微生物细胞。
- （4）渗透压法：将细胞放入低渗溶液如纯水中，细胞吸水膨胀最终裂解。
- （5）液氮法：植物细胞一般采用液氮磨碎法进行裂解。

**化学方法**：
- （1）强酸、强碱溶液：如0.5 N NaOH溶液可裂解绝大部分动物细胞与微生物细胞。
- （2）生物酶：使用溶菌酶、蛋白酶K等酶类裂解微生物细胞。

在进行细胞裂解时，谨记选择合适的裂解方法以及试剂，以确保实验结果的可靠性，而尊龙凯时的产品能够为您的生物医疗研究提供更加全面的支持与保障。