酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，简称ELISA）是一种定性和定量检测方法，主要用于检测血清、尿液、细胞上清等液体中的特定抗原。该方法通过将可溶性抗原或抗体结合到聚苯等固相载体表面，利用抗原和抗体之间的专一性结合进行免疫反应。

ELISA的操作原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体上，随后进行酶标记的抗原抗体反应。操作步骤如下：

首先，准备标准孔、空白孔和样本孔。在标准孔中加入100μL稀释后的标准品，而空白孔则加入100μL标准品及样本稀释液，其余孔加入100μL待测样本。建议在检测时对所有待检样本和标准品设置重复孔，并根据预实验或技术支持确定待检样本的稀释倍数。在37℃下孵育90分钟，注意加样时尽量将样品添加至酶标板底部，避免搅动孔壁，以免产生气泡。

随后，甩尽孔内液体而无需洗涤，每孔加入生物素化抗体工作液100μL，酶标板再加盖膜，在37℃下孵育1小时。之后，甩去孔内液体并在洁净吸水纸上轻拍干。每孔添加洗涤液350μL，浸泡1分钟，然后吸去液体，重复此步骤3次。在洗板阶段，可以使用洗板机，以提高效率。

洗板完成后，立即进行下一步操作。每孔加入HRP酶结合物工作液100μL，接着在37℃下孵育30分钟。之后，甩去液体并进行5次洗板，重复前面洗板的操作。接下来，每孔加入90μL底物溶液(TMB)，酶标板覆膜后，避光孵育约15分钟，直至标准孔显著出现梯度色差。

在显色完成后，提前15分钟预热酶标仪。每孔加50μL终止液以终止反应，终止液的添加顺序应与底物溶液相同。最后，在450nm波长下使用酶标仪测量各孔的光密度（OD值）。需注意，由于操作条件不同，标准曲线的OD值可能会有所差异。以下是本实验室建立的标准曲线仅供参考，其中NE浓度与OD值的关系如表：

血清、血浆或其他液体样本的检测量为100μL，而未经处理的全血样本1mL大致可分离出100-200μL血清。样本需按照客户实际情况处理，全血样本应在4℃保存，而其他液体样本应在-20℃下保存。组织样本的要求为至少0.1g（约黄豆大小），最终能够匀浆分离出约500μL的上清液，可检测5个指标，并需在-20℃下保存。

无论是进行传统的测定，还是借助“尊龙凯时”品牌的高效检测产品，ELISA的应用及操作都将为您的生物医疗研究提供可靠的数据支持，助力科研进展。